刘默芳团队揭示LARP7调节U6 2′-O-甲基化的新功能丨CellPress对话科学家
RNA剪接过程由核糖核蛋白（RNP）复合物，即剪接体完成。剪接体主要由五个小核RNP（snRNP）组成，即U1、U2、U4、U5和U6 snRNP。这些snRNP分别包括小核RNA（snRNA）及其相关蛋白。U6 snRNA作为最保守的剪接体snRNA，在剪接催化反应中发挥重要作用。U6 snRNA在转录后被大量修饰，主要为2′-O-甲基化，但这些修饰在pre-mRNA剪接中的作用以及它们在哺乳动物中的生理功能仍然未知。
中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）刘默芳研究员团队在非编码RNA的功能机制领域取得了多项重要成果。近日，刘默芳团队在Cell Press细胞出版社旗下的Molecular Cell期刊以“LARP7-Mediated U6 snRNA Modification Ensures Splicing Fidelity and Spermatogenesis in Mice”为题，发表了最新研究结果。该研究揭示在小鼠雄性生殖细胞中，RNA结合蛋白LARP7是U6 2′-O-甲基化修饰的关键辅助因子。机制上，LARP7促进U6装载到box C/D snoRNP，促进U6被后者进行2′-O-甲基化修饰。在小鼠雄性生殖系条件性敲除Larp7导致生殖细胞U6 2′-O-甲基化修饰剧烈减少，并引起大量pre-mRNA剪接改变、精子发生异常及雄性不育。重要的是，这些缺陷可被外源表达野生型LARP7，而不是U6装载缺陷突变型LARP7F38A所逆转。该研究揭示了LARP7调节U6 2′-O-甲基化的新功能，并显示此类修饰对剪接保真性和精子形成具有重要作用。
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该研究采用小鼠睾丸作为研究模型研究U6 snRNA修饰的调控机制及其在pre-mRNA剪接中的作用，因为在成年动物的组织器官中，睾丸展现了最高复杂性的转录组及最丰富的剪接可变性【1】【3】。
该研究发现，在小鼠睾丸中U6 snRNA和LARP7结合，而其他四个主要剪接体snRNA（U1，U2，U4和U5）与LARP7没有明显结合。有趣的是，尽管LARP7在小鼠胚胎的多种组织中均可检测到，但在成年动物中LARP7在睾丸中的表达水平远远高于其他组织。相似的，U6 snRNA在成年小鼠睾丸中的表达也显著高于其他组织；然而，LARP7的经典RNA配体7SK RNA，在睾丸组织中并无明显高表达。此外，相较于其他组织，睾丸中与7SK RNA结合的LARP7占比更小，仅少部分LARP7和7SK RNA结合。在Larp7条件性敲除小鼠中发现，睾丸中的U6表达水平并未改变，但其2′-O-甲基化水平显著降低，表明LARP7对U6 snRNA 2′-O-甲基化修饰至关重要。
研究者进一步探索了LARP7通过何种机制影响U6 snRNA 2′-O-甲基化修饰，发现LARP7和box C/D snoRNP中四个进化保守蛋白（如FBL，NOP56，NOP58和15.5K）【2】均相互作用。已知box C/D snoRNP介导核糖体RNA（rRNA）的2′-O-甲基化，其中FBL是催化作用的甲基转移酶【4】。因此，LARP7极有可能通过box C/D snoRNP影响U6 snRNA的2′-O-甲基化。慢病毒睾丸转导敲低FBL导致生殖细胞U6 2′-O-甲基化水平显著降低，证实box C/D snoRNP介导了雄性生殖细胞中U6 snRNA的2′-O-甲基化修饰；进一步，通过生化实验，研究者发现LARP7是box C/D snoRNP甲基化U6反应的激活子。Larp7敲除并不改变FBL在生殖细胞的表达及亚细胞定位，而LARP7可同时结合U6及匹配snoRNA，协助U6装载到box C/D snoRNP进而促进其2′-O-甲基化修饰。
U6 snRNA是剪接体的核心组分，LARP7促进U6 snRNA的2′-O-甲基化，那么此修饰是否为雄性生殖细胞中pre-mRNA剪接所必需呢？研究者通过分离Larp7条件性敲除小鼠和对照小鼠的精母细胞（spermatocytes；SCs）和球形精子细胞（round spermatids；RSs），结合利用转录组分析比较两期生殖细胞的pre-mRNA剪接差异，发现Larp7敲除SCs和RSs中均存在大量mRNA剪接变化，涉及了约2000个基因，表明LARP7对小鼠雄性生殖细胞中pre-mRNA剪接保真性至关重要。此外，已知LARP7通过与7SK RNA结合，负调控RNA聚合酶Ⅱ转录延伸。为探索LARP7在雄性生殖细胞基因转录中的作用，研究者接着比较了Larp7敲除和对照小鼠SCs及RSs的转录组，但结果并未发现显著差异，表明LARP7并非通过调节转录延伸过程来调控pre-mRNA剪接，提示在雄性生殖细胞中LARP7主要以不依赖于7SK RNA的方式发挥功能。进一步，通过睾丸慢病毒转导，研究者在Larp7敲除小鼠雄性生殖细胞中外源表达了野生型LARP7或U6装载缺陷突变型LARP7F38A，发现只有野生型LARP7能够有效拯救生殖细胞U6 2′-O-甲基化及pre-mRNA剪接准确性，表明LARP7介导的U6修饰是雄性生殖细胞pre-mRNA正确剪接所必需的。
研究者进一步探索了LARP7对小鼠精子发生和雄性生殖的影响，发现雄性Larp7条件性敲除小鼠均不育，而雌性的生殖能力正常。Larp7条件性敲除小鼠睾丸平均重量显著降低、多种精子发生关键基因的剪接异常、精子数量和活力剧减、精子形态异常，且其精子在体外受精分析中不能使野生型卵细胞受精。在Larp7敲除小鼠雄性生殖细胞中外源表达野生型LARP7可有效恢复Larp7敲除精子的形态和游动能力，而U6装载缺陷突变型LARP7F38A则无此效应，表明LARP7介导的U6修饰为精子细胞发育和精子生成所必需。
虽然大量研究证实U6 snRNA在转录后被广泛修饰，但U6修饰是如何调控、是否影响pre-mRNA的剪接以及在哺乳动物中的生理和病理功能等却仍然鲜为人知。此项研究揭示了box C/D snoRNP介导U6的2′-O-甲基化修饰，并发现LARP7在小鼠雄性生殖细胞中具有促进U6甲基化的功能。重要的是，LARP7介导的U6修饰为生殖细胞pre-mRNA准确剪接和精子生成所必需。尽管在成年动物中，LARP7主要在睾丸中高表达，但其在小鼠胚胎的多种组织中均有明显表达。因此，LARP7介导的U6修饰是否影响动物胚胎发育过程值得进行进一步研究。
Cell Press细胞出版社特别邀请论文通讯作者刘默芳研究员代表团队进行了专访，请她为大家进一步详细解读。
作者专访
Cell Press：本研究揭示了LARP7介导的U6甲基化修饰在小鼠雄性生殖细胞pre-mRNA剪接中的重要作用，同时本杂志的同期研究（Hasler et al）在人类细胞中也证实了部分观点，说明了LARP7功能的保守性和重要性。基于此项研究发现，后续研究还有哪些工作将要进行？
刘默芳研究员：在该项工作进行的过程中，我们还意外地发现部分LARP7杂合小鼠出现小眼、无眼和脚趾多指等发育异常的现象。我们猜测LARP7可能在早期发育中扮演重要角色，在后续研究中我们将对LARP7在胚胎发育方面的功能机制展开研究。
Cell Press：由于LARP7和U6 snRNA在成年动物睾丸中的表达显著高于其他组织，并且LARP7介导的U6甲基化修饰是小鼠雄性生殖细胞pre-mRNA正确剪接和精子生成所必需。该机制是否可能成为雄性避孕或者睾丸癌等药物研发靶点？
刘默芳研究员：是的，鉴于LARP7介导的U6甲基化修饰为雄性生殖细胞发育和精子形成所必需，LARP7可以作为一个潜在靶点研发雄性避孕新药物。如果研发药物抑制LARP7功能，使雄性生殖细胞U6修饰及pre-mRNA剪接受阻，则可以干扰精子发生起到雄性避孕的效果，而在药效去除、LARP7功能恢复后，精子发生又可恢复正常。此外，因为该机制对生殖细胞pre-mRNA准确剪接至关重要，靶向LARP7也可能有效干预生殖系睾丸癌的发生和进展。
Cell Press：本研究展现了极高水平的分子、细胞、动物研究技术，请简要介绍所运用的关键创新技术。
刘默芳研究员：在这项工作中，RTL-Q实验是一个用于检测U6的2′-O-甲基化的改进创新技术，在低浓度的dNTP条件下，2′-O-甲基化基团会阻碍RNA的反转录；通过与qPCR联用，可以简单快速检测U6的2′-O-甲基化修饰的情况。此外，体外的U6甲基化实验也是一个关键的技术，我们利用嗜热细菌的box C/D snoRNP，加入U6和LARP7或LARP7F38A突变体，在一定的反应条件下进行反应，验证了LARP7介导了U6的2′-O-甲基化修饰。还有，该工作还利用了慢病毒睾丸转导、雄性生殖细胞分离纯化等生殖生物学技术，也是该工作的一个特色。
Cell Press：研究过程中是否遇到困难，是如何攻克的？
刘默芳研究员：在这个工作中，遇到比较大的困难是小鼠睾丸中U6的纯化。我们利用biotin标记的探针去结合小鼠睾丸中的U6，由于该方法效率很低，尝试了好几次都无法达到实验需求。最后，我们进行扩大了样本量，用了40只小鼠睾丸，才得到实验所需的U6。
Cell Press：请您谈一谈对青年科研人员成长的建议。
刘默芳研究员：我想对从事做科研工作来说最重要的是坚持和拼搏。一个好的科研工作，背后需要大量的尝试和付出，需要科研工作者不断的坚持和拼搏。其次，合作也很重要。合作可以产生1+1>2的力量，在合作过程中，可以相互学习到很多知识和技能，触碰出很多灵感火花。当前这个工作就是我们实验室博后王鑫、研究生李智彤、闫越等一起合作完成的，同时我们也与德国Gunter Meister和Utz Fischer实验室、中山大学杨建华和复旦大学林金钟等实验室紧密合作。正因为有了这些合作，我们才能把这个工作高效地完成了，合作对于科研工作和科研工作者都是非常重要的。
论文通讯作者介绍
关于 刘默芳 研究员
分别于1991年、1994年在华东理工大学获学士、硕士学位，2000年在中科院上海生物化学研究所获博士学位。分别于2000 -2005年、2005-2006年在美国国家健康研究院癌症研究所 (National Cancer Institute, NIH)博士后研究、约翰霍浦金斯医学院遗传和分子生物学系任研究助理。2006-至今，中科院上海生化细胞所，先后担任co-PI、RNA研究技术平台主任、研究组长。2013年入选国家杰出青年科学基金获得者。担任多本期刊编委、中国生物化学与分子生物学会理事会理事及RNA专业委员会副主任。
实验室主页：http://www.sibcb.ac.cn/PI.asp?id=135
本文参考文献 （上下划动查看）
1. Kan, Z., Garrett-Engele, P.W., Johnson, J.M., and Castle, J.C. (2005). Evolutionarily conserved and diverged alternative splicing events show different expression and functional profiles. Nucleic Acids Res 33, 5659-5666.
2. Sloan, K.E., Warda, A.S., Sharma, S., Entian, K.D., Lafontaine, D.L.J., and Bohnsack, M.T. (2017). Tuning the ribosome: The influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol 14, 1138-1152.
3. Soumillon, M., Necsulea, A., Weier, M., Brawand, D., Zhang, X., Gu, H., Barthes, P., Kokkinaki, M., Nef, S., Gnirke, A., et al. (2013). Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Rep 3, 2179-2190.
4.Tollervey, D., Lehtonen, H., Jansen, R., Kern, H., and Hurt, E.C. (1993). Temperature-sensitive mutations demonstrate roles for yeast fibrillarin in pre-rRNA processing, pre-rRNA methylation, and ribosome assembly. Cell 72, 443-457.
相关论文信息
论文原文刊载于Cell Press细胞出版社旗下期刊Molecular Cell上，点击“阅读原文”或扫描下方二维码查看论文
论文标题：
LARP7-Mediated U6 snRNA Modification EnsuresSplicing Fidelity and Spermatogenesis in Mice
论文网址：
https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(20)30002-2
DOI:
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.01.002
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